Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μέθοδος υψηλής ακρίβειας για τη διάγνωση κληρονομικών παθολογιών, λοιμώξεων, ιογενών παθήσεων σε οποιοδήποτε στάδιο (οξεία ή χρόνια), καθώς και - σε πρώιμο στάδιο - πριν από εμφανείς εκδηλώσεις της νόσου εντοπίζοντας παθογόνα με βάση το DNA τους, το RNA , τα οποία είναι γενετικό υλικό, σε δείγματα που λαμβάνονται από έναν ασθενή. Και σήμερα θα μιλήσουμε για την ουσία, τα διαγνωστικά στάδια και τις αρχές των μεθόδων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), καθώς και για το κόστος της.
Τι είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Η βάση της ανάλυσης είναι η ενίσχυση (διπλασιασμός) - η δημιουργία πολλών αντιγράφων από ένα σύντομο κομμάτι DNA (δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ), το οποίο αντιπροσωπεύει το ανθρώπινο γενετικό σύμπλεγμα. Η μελέτη απαιτεί πολύ μικρή ποσότητα φυσιολογικής ουσίας (πτύελα, περιττώματα, ξύσιμο του επιθηλίου, χυμός προστάτη, αίμα, σπέρμα, αμνιακό υγρό, βλέννα, πλακούντας ιστός, ούρα, σάλιο, υπεζωκοτικό υγρό, εγκεφαλονωτιαίο υγρό). Σε αυτήν την περίπτωση, για παράδειγμα, στον ουρογεννητικό σωλήνα ενός ασθενούς, είναι δυνατόν να ανιχνευθεί ακόμη και ένα μόνο επιβλαβές μικρόβιο.
Η μέθοδος της PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) αναπτύχθηκε από τον Αμερικανό επιστήμονα K. Mullis, ο οποίος έλαβε το βραβείο Νόμπελ το 1993.
Χρησιμοποιείται ενεργά:
- στην έγκαιρη διάγνωση λοιμώξεων, γενετικών,
- σε ιατροδικαστική ιατρική εξέταση παρουσία εξαιρετικά μικρής ποσότητας DNA για έρευνα ·
- στην κτηνιατρική, φαρμακευτική, βιολογία, μοριακή γενετική ·
- για την ταυτοποίηση ενός ατόμου με DNA, επιβεβαίωση της πατρότητας ·
- στην παλαιοντολογία, την ανθρωπολογία, την οικολογία (κατά την παρακολούθηση της ποιότητας των προϊόντων, περιβαλλοντικών παραγόντων).
Αυτό το βίντεο θα σας πει λεπτομερώς τι είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης:
Σε ποιον ανατίθεται;
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης στη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών είναι μία από τις πιο αξιόπιστες μεθόδους ιδιαίτερης ακρίβειας και αξιοπιστίας. Για παράδειγμα, η αξιοπιστία της ανάλυσης PCR για τα χλαμύδια και πολλά άλλα παθογόνα είναι κοντά στο 100% (απόλυτο). Τις περισσότερες φορές, η διαδικασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης συνταγογραφείται σε ασθενείς οι οποίοι, όταν διαγνωστούν, έχουν δυσκολίες στην αναγνώριση ενός συγκεκριμένου παθογόνου.
Χρησιμοποιείται η εργαστηριακή δοκιμή PCR:
- για την ανίχνευση παθογόνων που προκαλούν μόλυνση των ουροποιητικών και γεννητικών οργάνων, τα οποία είναι δύσκολο να εντοπιστούν κατά τη χρήση καλλιεργειών ή μεθόδων ανοσολογίας ·
- να επαναδιαγνώσει τον ιό HIV στο αρχικό στάδιο σε περίπτωση θετικού αλλά αμφισβητήσιμου αποτελέσματος της αρχικής δοκιμής (για παράδειγμα, σε νεογέννητα από γονείς που έχουν μολυνθεί με AIDS) ·
- να διαπιστωθεί ογκολογική ασθένεια σε πρώιμο στάδιο (μελέτη μεταλλάξεων ογκογόνων) και ατομική διόρθωση του θεραπευτικού σχήματος σε έναν συγκεκριμένο ασθενή ·
- με στόχο την έγκαιρη ανίχνευση και πιθανή θεραπεία κληρονομικών παθολογιών.
Έτσι, οι μελλοντικοί γονείς κάνουν μια ανάλυση για να μάθουν αν είναι φορείς γενετικής παθολογίας, στα παιδιά, η PCR καθορίζει την πιθανότητα ευαισθησίας σε μια ασθένεια που κληρονομείται.
- για την ανίχνευση παθολογιών του εμβρύου σε μια πρώιμη περίοδο κύησης (μεμονωμένα κύτταρα ενός αναπτυσσόμενου εμβρύου εξετάζονται για πιθανές μεταλλάξεις).
- σε ασθενείς πριν από τη μεταμόσχευση οργάνων - για "πληκτρολόγηση ιστών" (προσδιορισμός της συμβατότητας ιστών).
- για τον εντοπισμό επικίνδυνων παθογόνων οργανισμών στο αιμοδοτούμενο αίμα ·
- σε νεογέννητα μωρά - για τον εντοπισμό κρυφών λοιμώξεων.
- για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της αντιιικής και αντιμικροβιακής θεραπείας.
Γιατί να περάσετε από μια τέτοια διαδικασία
Δεδομένου ότι η PCR είναι μια πολύ αποτελεσματική διαγνωστική μέθοδος που δίνει σχεδόν 100% αποτέλεσμα, χρησιμοποιείται η διαδικασία:
- να επιβεβαιώσει ή να αποκλείσει την τελική διάγνωση ·
- ταχεία αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.
Σε πολλές περιπτώσεις, η PCR είναι η μόνη δυνατή δοκιμή για την ανίχνευση μιας αναπτυσσόμενης νόσου εάν άλλες βακτηριολογικές, ανοσολογικές και ιολογικές διαγνωστικές τεχνικές είναι άχρηστες.
- Οι ιοί ανιχνεύονται με PCR αμέσως μετά τη μόλυνση και πριν εμφανιστούν σημάδια ασθένειας. Η έγκαιρη ανίχνευση του ιού επιτρέπει την άμεση θεραπεία.
- Το λεγόμενο "ιικό φορτίο" (ή - ο αριθμός των ιών στο σώμα) καθορίζεται επίσης με ποσοτική ανάλυση DNA.
- Τα συγκεκριμένα παθογόνα (για παράδειγμα, ο βακίλλος του Koch) είναι δύσκολα και χρειάζονται πολύ χρόνο για καλλιέργεια. Η ανάλυση PCR σάς επιτρέπει να προσδιορίζετε γρήγορα τον ελάχιστο αριθμό παθογόνων (ζωντανών και νεκρών) σε δείγματα που είναι κατάλληλα για δοκιμή.
Χρησιμοποιείται λεπτομερής ανάλυση DNA του παθογόνου:
- να προσδιορίσετε την ευαισθησία του σε συγκεκριμένους τύπους αντιβιοτικών, που σας επιτρέπει να ξεκινήσετε αμέσως τη θεραπεία.
- για τον έλεγχο της εξάπλωσης επιδημιών σε κατοικίδια, άγρια \u200b\u200bζώα ·
- για τον εντοπισμό και την παρακολούθηση νέων μολυσματικών μικροβιακών ειδών και υποτύπων παθογόνων που πυροδότησαν προηγούμενες επιδημίες.
Τύποι διαγνωστικών
Τυπική μέθοδος
Η ανάλυση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματοποιείται με βάση πολλαπλή ενίσχυση (διπλασιασμός) ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA και RNA χρησιμοποιώντας ειδικά ένζυμα εκκινητή. Ως αποτέλεσμα της αλυσίδας αντιγραφής, λαμβάνεται αρκετό υλικό για έρευνα.
Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, αντιγράφεται μόνο το επιθυμητό θραύσμα (που αντιστοιχεί στις καθορισμένες συγκεκριμένες συνθήκες) και εάν υπάρχει πραγματικά στο δείγμα.
Ο τρόπος λειτουργίας του PCR περιγράφεται σε αυτό το λεπτομερές βίντεο με χρήσιμα διαγράμματα:
Άλλες μέθοδοι
- PCR σε πραγματικό χρόνο... Σε αυτόν τον τύπο έρευνας, η διαδικασία εντοπισμού ενός δεδομένου θραύσματος DNA ξεκινά μετά από κάθε κύκλο και όχι μετά την ολοκλήρωση ολόκληρης της αλυσίδας για 30-40 κύκλους. Αυτός ο τύπος μελέτης σάς επιτρέπει να λαμβάνετε πληροφορίες σχετικά με την ποσότητα του παθογόνου (ιός ή μικρόβιο) στο σώμα, δηλαδή να πραγματοποιήσετε ποσοτική ανάλυση.
- RT-PCR (λειτουργία αντίστροφης μεταγραφής)... Αυτή η ανάλυση χρησιμοποιείται για την εύρεση RNA με ένα μόνο κλώνο για την ανίχνευση ιών, η γενετική βάση του οποίου είναι ακριβώς το RNA (για παράδειγμα, ιός ηπατίτιδας C, ιός ανοσοανεπάρκειας). Σε μια τέτοια μελέτη, χρησιμοποιείται ένα ειδικό ένζυμο - αντίστροφη μεταγραφάση και ένας συγκεκριμένος εκκινητής, και ένα μονόκλωνο DNA βασίζεται στο RNA. Στη συνέχεια, ο δεύτερος κλώνος DNA ανακτάται από αυτόν τον κλώνο και εκτελείται η τυπική διαδικασία.
Ενδείξεις για
Η διαδικασία PCR χρησιμοποιείται στην κλινική μολυσματικών ασθενειών, νεογνολογίας, μαιευτικής, παιδιατρικής, ουρολογίας, γυναικολογίας, αφροδισιολογίας, νευρολογίας, νεφρολογίας, οφθαλμολογίας.
Ενδείξεις για τους σκοπούς της ανάλυσης:
- Ανακαλύπτοντας τον κίνδυνο ανάπτυξης γενετικών ανωμαλιών σε ένα παιδί με πιθανότητα κληρονομικών παθολογιών.
- διάγνωση και των δύο γονέων κατά τον προγραμματισμό μιας εγκυμοσύνης ή μιας σοβαρής κατάστασης της μητέρας κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης.
- δυσκολίες στη σύλληψη, εντοπίζοντας τις αιτίες της στειρότητας ·
- υποψία γεννητικών λοιμώξεων στο οξύ στάδιο και με συμπτώματα μετάβασης σε χρόνια.
- ανίχνευση των αιτιών φλεγμονωδών διεργασιών άγνωστης προέλευσης ·
- απροστάτευτο περιστασιακό και επαναλαμβανόμενο σεξ
- προσδιορισμός της ευαισθησίας ενός παθογόνου μικροοργανισμού σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά ·
- για ασθενείς με υποψία λανθάνουσας λοίμωξης για την ανίχνευση παθογόνων πριν εμφανιστούν εμφανή συμπτώματα (προκλινική διάγνωση).
- ασθενείς να επιβεβαιώσουν την ανάρρωση από ασθένεια (αναδρομική διάγνωση):
Τα διαγνωστικά χρησιμοποιούνται επίσης όταν είναι απαραίτητο να προσδιοριστούν με ακρίβεια τα ακόλουθα παθογόνα:
- ιοί ηπατίτιδας (A B C G), ιοί ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, κυτταρομεγαλοϊός.
- χολέρα vibrio;
- ιός απλού έρπητα, ερπετοειδές είδος ·
- ρετρό - αδενο - και ρινοϊούς.
- ιούς ερυθράς, ιοί Epstein-Barr, ανεμευλογιά (Zoster - ιός).
- parvo - και picornovirus.
- το βακτήριο Helicobacter pylori ·
- λεγεωνέλλα, παθογόνοι τύποι κόλι
- Η ασθένεια του σταφυλοκοκου;
- παθογόνο;
- κλοστρίδια, διφθερίτιδα και αιμόφιλος influenzae
Χρησιμοποιείται επίσης για τον εντοπισμό λοιμώξεων:
- Λοιμώδης μονοπυρήνωση;
- μπορελίωση, λιστερίωση, εγκεφαλίτιδα από κρότωνες
- καντιντίαση που προκαλείται από Candida?
- λοιμώξεις των γεννητικών οργάνων - τριχομονάση, ουρεπλάσμωση, χλωμό treponema, gardnerellosis, γονόρροια, μυκοπλάσμωση, χλαμύδια.
- φυματίωση.
Αντενδείξεις για
Δεδομένου ότι η διαδικασία δεν γίνεται με τον ασθενή, χωρίς καμία επίδραση στο σώμα, αλλά με το βιολογικό υλικό που έχει ληφθεί για έρευνα, δεν υπάρχουν αντενδείξεις για PCR λόγω της απουσίας πιθανού κινδύνου.
Ωστόσο, η δειγματοληψία βιοϋλικού από τον αυχενικό σωλήνα της μήτρας δεν πραγματοποιείται μετά τη διαδικασία κολποσκόπησης. Η παράδοση επιχρισμάτων, θραυσμάτων για ανάλυση επιτρέπεται μόνο 4 - 6 ημέρες μετά το τέλος της εμμήνου ρύσεως και την πλήρη διακοπή της απόρριψης.
Είναι η μέθοδος ασφαλής
Δεν είναι αδύνατη καμία αρνητική επίδραση στον ασθενή κατά τη διάρκεια μιας μεμονωμένης μελέτης του βιοϋλικού του σε εργαστηριακές συνθήκες.
Προετοιμασία της διαδικασίας (παράδοση βιολογικών ουσιών για ανάλυση)
Ως δείγμα για ανάλυση PCR, στο οποίο ανιχνεύεται το DNA ενός ξένου παθογόνου, εξυπηρετούν κάθε βιολογικό υγρό, ιστός, εκκρίσεις του σώματος. Η δειγματοληψία της εξεταζόμενης ουσίας πραγματοποιείται με τη μορφή λήψης αίματος από φλέβα, ξύσιμο από λάρυγγα, ρινική κοιλότητα, ουρήθρα, υπεζωκοτική κοιλότητα, τράχηλος.
Πριν από τη διαγνωστική διαδικασία, ο γιατρός εξηγεί στον ασθενή ποιο υλικό θα ληφθεί:
- Κατά την εξέταση για λοιμώξεις των γεννητικών οργάνων, απόρριψη από τα γεννητικά όργανα, ούρα, λαμβάνεται επίχρισμα από την ουρήθρα.
- Όταν δοκιμάζονται για ερπητικές λοιμώξεις, κυτταρομεγαλοϊό, μονοπυρήνωση - παίρνουν ούρα, επίχρισμα από το λαιμό, για ηπατίτιδα, τοξοπλάσμωση - αίμα από φλέβα.
- Για τη διάγνωση διαφόρων τύπων, λαμβάνεται εγκεφαλονωτιαίο υγρό.
- Στην πνευμονολογία, τα δείγματα για ανάλυση είναι πτύελα και υπεζωκοτικό υγρό.
- Όταν πραγματοποιείται μελέτη πιθανών ενδομήτριων λοιμώξεων κατά τη μεταφορά εμβρύου, χρησιμοποιούνται αμνιακό υγρό και πλακούντα κύτταρα για ανάλυση.
Η αξιοπιστία και η ακρίβεια της ανάλυσης εξαρτάται από τη στειρότητα των συνθηκών κατά τη λήψη του υλικού. Δεδομένου ότι η μελέτη PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη, οποιαδήποτε μόλυνση της υπό δοκιμή ουσίας μπορεί να παραμορφώσει το αποτέλεσμα.
Η κατάλληλη προετοιμασία για την παράδοση βιοϋλικών δεν παρουσιάζει δυσκολίες για τους ασθενείς. Υπάρχουν ορισμένες προτάσεις:
- όταν αναλύονται για γεννητικές λοιμώξεις:
- εξαιρέστε τις οικείες επαφές 72 ώρες πριν από την παράδοση του υλικού.
- σταματήστε να χρησιμοποιείτε κολπικά προϊόντα 3 ημέρες νωρίτερα.
- από το απόγευμα της προηγούμενης ημέρας, μην καθαρίζετε την περιοχή που μελετάτε.
- αποκλείετε την ούρηση για 3 έως 4 ώρες όταν παίρνετε ένα δείγμα από την ουρήθρα.
- σταματήστε να παίρνετε αντιβιοτικά ένα μήνα πριν δοκιμαστείτε για λοιμώξεις
- αίμα δίνεται το πρωί πριν το φαγητό και το πόσιμο?
- η συλλογή του πρώτου πρωινού μερίδας ούρων πραγματοποιείται σε αποστειρωμένο δοχείο μετά από ενδελεχή οικεία τουαλέτα
Διαβάστε για το πώς γίνεται η διαγνωστική χρήση της τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης παρακάτω.
Πώς είναι η διαδικασία
Κατά την εκτέλεση μελέτης PCR, ορισμένοι κύκλοι επαναλαμβάνονται ξανά και ξανά στον αντιδραστήρα (ενισχυτής ή θερμικός κύκλος):
- Το πρώτο βήμα είναι η μετουσίωση... Σάλιο, αίμα, βιοψία, γυναικολογικές εξετάσεις, πτύελα, στα οποία υπάρχει υποψία παρουσίας DNA (ή RNA) του παθογόνου, τοποθετούνται σε έναν ενισχυτή, όπου το υλικό θερμαίνεται και το DNA χωρίζεται σε δύο ξεχωριστούς κλώνους.
- Το δεύτερο βήμα είναι ανόπτηση ή ψύξη ελαφρώς του υλικού και προσθήκη εκκινητών σε αυτό που είναι σε θέση να αναγνωρίζουν και να συνδέονται με τις επιθυμητές περιοχές στο μόριο DNA.
- Το τρίτο βήμα είναι η επιμήκυνση - συμβαίνει μετά την προσάρτηση 2 εκκινητών σε καθένα από τους κλώνους DNA. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, ολοκληρώνεται ένα κομμάτι του DNA του παθογόνου και σχηματίζεται ένα αντίγραφο.
Αυτοί οι κύκλοι επαναλαμβάνονται σε τύπο «αλυσιδωτής αντίδρασης», κάθε φορά που οδηγεί σε επικάλυψη αντιγράφων ενός συγκεκριμένου κομματιού DNA (για παράδειγμα, ένα τμήμα όπου προγραμματίζεται ένας συγκεκριμένος ιός) Μέσα σε λίγες ώρες, σχηματίζονται πολλαπλά αντίγραφα του θραύσματος DNA και αποκαλύπτεται η παρουσία τους στο δείγμα. Μετά από αυτό, πραγματοποιείται ανάλυση και σύγκριση των αποτελεσμάτων με τα δεδομένα της βάσης δεδομένων διαφόρων τύπων παθογόνων για τον προσδιορισμό του τύπου μόλυνσης.
Διαβάστε για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και το συμπέρασμα με βάση την αντίδραση PCR παρακάτω.
Αποκωδικοποίηση των αποτελεσμάτων
Το τελικό αποτέλεσμα της μελέτης εκδίδεται σε 1-2 ημέρες μετά την παράδοση του βιολογικού υλικού. Συχνά - ήδη την πρώτη ημέρα μετά την ανάλυση.
Ποιοτική ανάλυση
- ΑρνητικόςΤο αποτέλεσμα σημαίνει ότι δεν βρέθηκαν ίχνη μολυσματικών παραγόντων στην ουσία που υποβλήθηκε για έρευνα.
- ΘετικόςΩς αποτέλεσμα νοείται η ανίχνευση παθογόνων ιών ή βακτηρίων σε ένα βιολογικό δείγμα με πολύ υψηλό βαθμό ακρίβειας κατά τη στιγμή της παράδοσης.
Εάν το αποτέλεσμα είναι θετικό, αλλά δεν υπάρχουν ενδείξεις ενεργοποίησης της λοίμωξης, αυτή η κατάσταση του σώματος ονομάζεται ασυμπτωματικός «υγιής φορέας». Τις περισσότερες φορές παρατηρείται κατά τη λήψη βιοϋλικών από ένα συγκεκριμένο μέρος (αυχενικός σωλήνας, ουρήθρα, στοματική κοιλότητα) σε ιογενείς νόσους. Η θεραπεία σε αυτήν την περίπτωση δεν απαιτείται, αλλά η συνεχής ιατρική παρακολούθηση είναι υποχρεωτική, καθώς υπάρχει η πιθανότητα:
- εξάπλωση του ιού από φορείς και μόλυνση υγιών ανθρώπων ·
- ενεργοποίηση της διαδικασίας και μετάβαση της νόσου σε χρόνια μορφή.
Ωστόσο, εάν μια εξέταση αίματος είναι θετική, αυτό δείχνει ότι η λοίμωξη έχει πλήξει το σώμα και αυτό δεν είναι πλέον κατάσταση φορέα, αλλά παθολογία που απαιτεί άμεση ειδική θεραπεία.
Ποσοτική ανάλυση
Το ποσοτικό αποτέλεσμα καθορίζεται από έναν ειδικό ειδικά για έναν συγκεκριμένο τύπο μόλυνσης. Στη βάση του, είναι δυνατόν να εκτιμηθεί ο βαθμός ανάπτυξης, το στάδιο της νόσου, το οποίο καθιστά δυνατή τη γρήγορη συνταγογράφηση της σωστής θεραπείας.
μέσο κόστος
Οι τιμές για την πραγματοποίηση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης καθορίζονται από: τον τύπο της μελέτης, την πολυπλοκότητα της αναγνώρισης του παθογόνου, τη δυσκολία λήψης βιολογικού υλικού, τον τύπο ανάλυσης (ποιοτική ή ποσοτική), το επίπεδο τιμών στο εργαστήριο.
Από την άλλη πλευρά, στη μελέτη της PCR, πολλά παθογόνα μπορούν να ανιχνευθούν ταυτόχρονα κατά τη λήψη ενός τύπου υλικού για ανάλυση. Αυτό εξοικονομεί άλλες εργαστηριακές δοκιμές.
Κατά προσέγγιση, το κόστος της ανάλυσης PCR σε ρούβλια:
- gonococcus, gardnerella, Trichomonas vaginalis - από το 180
- chlamydia trachomatis - από το 190
- ιός θηλώματος - από 380 έως 500
- βιοκένωση του ουρογεννητικού συστήματος στις γυναίκες (ποσοτική και ποιοτική αξιολόγηση της μικροχλωρίδας) - από 800.
Για ακόμη πιο χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με τη δοκιμή PCR, δείτε το παρακάτω βίντεο:
Η ουσία της διαγνωστικής μεθόδου PCR
Η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στις αρχές της μοριακής βιολογίας και ανήκει στον τομέα της γενετικής έρευνας.
Κάθε ζωντανός οργανισμός περιέχει στη δομή του μόρια νουκλεϊνικού οξέος - DNA και RNA. Αυτό είναι ένα είδος γενετικού διαβατηρίου που βοηθά να προσδιοριστεί σε ποιο είδος ανήκει αυτός ή αυτός ο «φορέας». Ωστόσο, για τη σάρωση αυτού του «διαβατηρίου», μέχρι πρόσφατα, απαιτήθηκε μια ελάχιστη ποσότητα βιολογικού υλικού. Εάν η συγκέντρωση του DNA ήταν χαμηλότερη από την απαιτούμενη, η διαγνωστική ανάλυση δεν ήταν δυνατή.
Κατά τη διάγνωση με PCR, ένα δείγμα βιολογικού υλικού αντιμετωπίζεται με ειδικά ένζυμα (πολυμεράσες), τα οποία σας επιτρέπουν να ξεκινήσετε τη διαδικασία πολλαπλής αντιγραφής του υπάρχοντος DNA (RNA). Χρησιμοποιώντας μια αλυσιδωτή αντίδραση, σύμφωνα με την αρχή της γεωμετρικής εξέλιξης, σε λίγες μόνο ώρες, μπορούν να ληφθούν αρκετές δεκάδες τρισεκατομμύρια αντίγραφα από ένα μόριο νουκλεϊκού οξέος. Αυτός ο τόμος είναι περισσότερο από αρκετός για οποιεσδήποτε συγκριτικές μελέτες.
Για την ανάλυση, χρησιμοποιείται ένας ενισχυτής, στον οποίο, υπό αυστηρό καθεστώς θερμοκρασίας, λαμβάνει χώρα η διαδικασία επαναλαμβανόμενης αντιγραφής DNA. Συνήθως αρκούν 20-30 κύκλοι αναπαραγωγής. Κάθε ένα από αυτά περιλαμβάνει 3 διαδοχικά στάδια:
- μετουσίωση - θέρμανση της μήτρας DNA στους 96 ° C με την καταστροφή δεσμών υδρογόνου μεταξύ γειτονικών αλυσίδων.
- ανόπτηση - μείωση της θερμοκρασίας κατά 4 ° C για τη δημιουργία ενός πιρουνιού αναπαραγωγής.
- επιμήκυνση - έναρξη πολυμεράσης DNA για τη σύνθεση νέων νουκλεοτιδικών αλυσίδων με βάση τη μητρική.
Κάθε κύκλος τριών σταδίων διαρκεί κατά μέσο όρο 15-20 λεπτά.
Οφέλη της διάγνωσης PCR
Η ανάλυση PCR είναι εξαιρετικά τεχνολογική και απαιτεί επαγγελματισμό από το εργαστήριο, αλλά για τη σύγχρονη ιατρική έχει γίνει πηγή πρωτοφανών ευκαιριών στον τομέα της ακριβούς διαγνωστικής.
Πλεονεκτήματα PCR:
- ευελιξία (οποιοδήποτε βιολογικό υλικό μπορεί να εξεταστεί - από κύτταρα αίματος, σάλιο και μαλλιά έως ύποπτους λεκέδες σε σκηνή εγκλήματος).
- υψηλό όριο ευαισθησίας (η μέθοδος είναι ικανή να δώσει αποτέλεσμα εάν υπάρχουν μεμονωμένα κύτταρα ή μεμονωμένα μόρια DNA στο δείγμα).
- πολλαπλές εργασίες - σε μία προσέγγιση, μπορούν να αναγνωριστούν ταυτόχρονα διάφοροι τύποι φορέων πληροφοριών (οι βακτηριολογικές μέθοδοι δεν είναι ικανές για αυτό, καθώς απαιτούν διαφορετικά θρεπτικά μέσα για κάθε τύπο μικροοργανισμού)
- την ικανότητα διεξαγωγής ακριβούς ποσοτικής ανάλυσης ·
- ταχύτητα επεξεργασίας (σε αντίθεση με άλλους τύπους γενετικής έρευνας, η διάγνωση PCR διαρκεί μόνο 5-7 ώρες).
- την ακρίβεια του αποτελέσματος (εάν παρατηρηθεί η τεχνολογία, αποκλείεται πρακτικά ένα σφάλμα) ·
- σχετικά χαμηλό κόστος (η ανάλυση PCR δεν υπερβαίνει τη μέση τιμή για τυπικές δοκιμές).
Όλα αυτά τα πλεονεκτήματα επιτρέπουν τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης για τακτική παρακολούθηση της διαδικασίας θεραπείας.
Ο προγραμματιστής της μεθόδου διάγνωσης PCR κέρδισε το βραβείο Νόμπελ για το "πνευματικό του παιδί" για έναν λόγο. Η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης επιτρέπει:
- για τον προσδιορισμό του στελέχους του μολυσματικού παράγοντα με ελάχιστη περιεκτικότητα στο βιοϋλικό (έως και μεμονωμένες ιογενείς δομές) ·
- υπολογίστε την ακριβή συγκέντρωση του παθογόνου σε ολόκληρο το σώμα (για να προσδιορίσετε τη βέλτιστη δόση φαρμάκων).
- αξιολογεί τον βαθμό παθολογικής επίδρασης στον ασθενή και εντοπίζει στελέχη με υψηλή φαρμακολογική αντοχή.
- καθιερώστε διαδοχικά στάδια μόλυνσης και κάνετε περαιτέρω πρόγνωση
Είναι ενδιαφέρον! Οι δυνατότητες ανάλυσης PCR είναι πολύ ευρύτερες από την ποσοτική και ποιοτική αξιολόγηση του μολυσματικού υποβάθρου στο ανθρώπινο σώμα. Εκτός από την ανίχνευση λοιμώξεων, χρησιμοποιείται για την καθιέρωση συγγένειας, τον προσδιορισμό της προσωπικότητας, τον εντοπισμό γενετικών παθολογιών, τη σύγκριση βιοϋλικών στην ιατροδικαστική επιστήμη.
Ποιες λοιμώξεις μπορούν να εντοπιστούν με διαγνωστικά PCR
Η ανάλυση PCR μπορεί να υπολογίσει με μεγάλη ακρίβεια κάθε μολυσματικό φορέα που περιλαμβάνεται στον σύγχρονο ιατρικό κατάλογο ασθενειών:
- παθογόνα όλων των τύπων ηπατίτιδας (η PCR σας επιτρέπει να προσδιορίσετε την πηγή μόλυνσης στο στάδιο της περιόδου επώασης και να ξεκινήσετε τη θεραπεία πολύ πριν εμφανιστούν τα συμπτώματα της νόσου).
- παθογόνα HIV και ΣΜΝ (ουρεάπλασμα, μυκόπλασμα, χλαμύδια, Trichomonas).
- μια ομάδα μολύνσεων TORCH (σχετική κατά την εξέταση εγκύων γυναικών για έγκαιρη ανίχνευση παθολογιών του εμβρύου) ·
- φυματίωση (λανθάνουσα μορφή της νόσου)
- καντιντίαση (λανθάνουσα μορφή)
- λοίμωξη εντεροϊού
- μονοπυρήνωση;
- λιστερίωση;
- σαλμονέλλωση (ορισμός συγκεκριμένου στελέχους).
- ιός θηλώματος;
- gardnerellosis;
- ιός εγκεφαλίτιδας που προκαλείται από κρότωνες.
Ιδιαίτερα δημοφιλής είναι η ανάλυση ενδοκυτταρικών λοιμώξεων (για παράδειγμα χλαμύδια), η διαπίστωση των οποίων με τον συνήθη τρόπο είναι δύσκολη ακόμη και με υψηλή συγκέντρωση αυτών των μικροοργανισμών στους ιστούς του ασθενούς.
Λαμβάνοντας υπόψη τη μέθοδο πολλαπλών εργασιών, είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανάλυση PCR για 12 βασικές λοιμώξεις. Μια ολοκληρωμένη προσέγγιση είναι μια βολική επιλογή για συστηματική εξέταση του σώματος για λοιμώξεις των γεννητικών οργάνων με ελάχιστο κίνδυνο εσφαλμένης διάγνωσης.
Σε μια σημείωση! Με τη βοήθεια των διαγνωστικών PCR, γίνεται πρόγνωση για τις λεγόμενες «αδρανείς» μορφές λοιμώξεων που βρίσκονται στο σώμα χωρίς να εκδηλώνονται με συμπτώματα της νόσου (ιδιαίτερα σημαντική για τη θεραπεία γυναικολογικών και ουρολογικών παθήσεων, φυματίωσης, εγκεφαλίτιδας που προκαλείται από κρότωνες, θηλώματος).
Ποια βιολογικά υλικά διερευνούνται
Δεν υπάρχουν καθιερωμένοι κανόνες και όρια. Η ευελιξία της μεθόδου επιτρέπει τη χρήση οποιουδήποτε βιολογικού υλικού για ανάλυση:
- ένα επίχρισμα από τον κόλπο, ξύσιμο από την ουρήθρα και τον αυχενικό σωλήνα (για τη διάγνωση των ΣΜΝ).
- ούρα (φυματίωση, ορισμένα ΣΜΝ, κυτταρομεγαλοϊός)
- αίμα (HIV, ηπατίτιδα, λοιμώξεις TORCH)
- μπατονέτα (μονοπυρήνωση, κυτταρομεγαλοϊός)
- εγκεφαλονωτιαίο υγρό (νευρο-μόλυνση)
- αμνιακό υγρό και πλακούντας ιστός (ανάλυση για μολύνσεις TORCH για την πρόληψη παθολογιών ανάπτυξης του εμβρύου).
- υπεζωκοτικό υγρό (λοιμώξεις των πνευμόνων).
Για άλλους τύπους διαγνωστικών PCR (δημιουργία σχέσης, σύγκριση βιοϋλικών), χρησιμοποιούνται σάλιο, μαλλιά, νύχια, επιθηλιακά κύτταρα και άλλες πηγές γενετικών πληροφοριών.
Σε μια σημείωση! Η διαγνωστική μέθοδος PCR αποκαλύπτει παθογόνα όχι μόνο στη σύνθεση των ζωντανών ιστών, αλλά και σε δείγματα εδάφους, νερού, φυτικών υποστρωμάτων. αξιολογεί την παθογόνο δραστηριότητα μικροοργανισμών τόσο στο ανθρώπινο σώμα όσο και στο περιβάλλον του (η παρουσία μιας καθιερωμένης πηγής της νόσου θα επιτρέψει τη λήψη κατάλληλων μέτρων για την πρόληψή της στο μέλλον)
Πώς να προετοιμαστείτε για τη δοκιμή
Οι ασθενείς της κλινικής μας δεν χρειάζεται να αναρωτιούνται πού να εξεταστούν για PCR. Παρέχουμε όλες τις προϋποθέσεις για την αποστειρωμένη δειγματοληψία υλικού και την αποστολή του στο εργαστήριο.
Δεν απαιτείται ειδική εκπαίδευση, αλλά συνιστάται να ακολουθείτε τη λίστα των γενικών συστάσεων. Σταματήστε το αλκοόλ σε λίγες μέρες, περιορίστε το κάπνισμα, εάν είναι δυνατόν, εξαιρέστε τα φάρμακα, προσπαθήστε να αποφύγετε αγχωτικές καταστάσεις και έντονη σωματική άσκηση.
Το υπόλοιπο της προετοιμασίας για τη δοκιμή εξαρτάται από τον τύπο του βιοϋλικού:
- πριν πάρετε ένα επίχρισμα ή ξύσιμο για ουρογεννητικές λοιμώξεις, αποφύγετε τη σεξουαλική επαφή για 2-3 ημέρες (οι γυναίκες πρέπει να βεβαιωθούν ότι η ημέρα του τεστ δεν πέφτει τις ημέρες της εμμήνου ρύσεως).
- πριν πάρετε μια εξέταση αίματος για PCR, αποφύγετε να τρώτε το πρωί (η δοκιμή γίνεται με άδειο στομάχι) και πίνετε ένα ποτήρι καθαρό ακόμα νερό.
- πριν από την παροχή ούρων, αποφύγετε τα τρόφιμα που επηρεάζουν την οξύτητα των ούρων (φρούτα, κρέας, όσπρια, βότανα).
Σπουδαίος! Η πιο σημαντική απαίτηση στη διάγνωση PCR των λοιμώξεων είναι η καθαρότητα του βιοϋλικού. Επομένως, προσπαθήστε να καταβάλλετε κάθε προσπάθεια για να αποκλείσετε τη μόλυνση των ιστών με ξένο DNA (φροντίστε τη στειρότητα του περιέκτη μεταφοράς, την προσωπική υγιεινή, τα καθαρά ρούχα).
Ανάλυση αποκωδικοποίησης PCR
Τα αποτελέσματα μιας ποιοτικής ανάλυσης PCR για λοιμώξεις εκδίδονται με τη μορφή πίνακα, όπου δίπλα σε κάθε μολυσματικό παράγοντα υπάρχει ένα αντίστοιχο σημάδι:
- αρνητικό αποτέλεσμα (δεν υπάρχει παθογόνο αυτού του τύπου).
- θετικό αποτέλεσμα (ανιχνεύθηκε παθογόνο).
Η απουσία συμπτωμάτων της νόσου μπορεί να μην αντιστοιχεί στην πραγματική εικόνα, επομένως για κάποιον τα αποτελέσματα της ανάλυσης θα είναι απρόσμενα. Μην ανησυχείτε: ο εντοπισμός ενός μολυσματικού παράγοντα στα αρχικά στάδια είναι το κλειδί για μια επιτυχημένη και γρήγορη θεραπεία.
Κατά τη διεξαγωγή ποσοτικής ανάλυσης PCR, μπορείτε να εκτιμήσετε τον βαθμό του ιικού φορτίου (μάθετε τον αριθμό αντιγράφων του ιού ανά μονάδα όγκου). Χάρη σε αυτόν τον τύπο μελέτης, είναι δυνατόν να προσδιοριστεί η ένταση της πορείας της μολυσματικής διαδικασίας, καθώς και να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας.
Ανάλυση PCR: τιμή και όροι
Ο μέσος χρόνος διάγνωσης είναι 5-10 ώρες. Τα αποτελέσματα με τη μορφή πίνακα εκδίδονται την επόμενη εργάσιμη ημέρα μετά τη δειγματοληψία του βιοϋλικού.
Όταν επιλέγετε μια ανάλυση PCR, η τιμή δεν έχει σημασία. Κατά μέσο όρο, το κόστος δεν υπερβαίνει το εύρος των συμβατικών βιοχημικών δοκιμών και, σε αντίθεση με το μεγαλύτερο μέρος των γενετικών μελετών, είναι διαθέσιμο σε όλους τους ασθενείς.
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μέθοδος υψηλής ακρίβειας μοριακών γενετικών διαγνωστικών, η οποία επιτρέπει την ανίχνευση διαφόρων μολυσματικών και κληρονομικών ασθενειών στον άνθρωπο, τόσο στα οξεία όσο και στα χρόνια στάδια, και πολύ πριν από την εκδήλωση της νόσου.
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) αναπτύχθηκε το 1983 από τον Carey Mullis (ΗΠΑ), για το οποίο το 1993 του απονεμήθηκε το βραβείο Νόμπελ Χημείας.
Η ανάλυση PCR έχει γίνει ένα είδος «χρυσού προτύπου» για τις περισσότερες λοιμώξεις. Οι περισσότεροι ειδικοί το συναντούν σχεδόν κάθε μέρα και δεν μπορούν να φανταστούν να κάνουν μια τελική διάγνωση χωρίς αυτήν. Η PCR γίνεται συχνά η μόνη αντίδραση για την ανίχνευση ενεργών σταδίων της νόσου εκείνες τις στιγμές που άλλες βακτηριολογικές, ιολογικές, ανοσολογικές διαγνωστικές μέθοδοι δεν λειτουργούν.
Τα πλεονεκτήματα της διάγνωσης PCR στη σύγχρονη ιατρική:
Άμεση ανίχνευση της παρουσίας του παθογόνου (συγκεκριμένα, μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA ή RNA του παθογόνου) στο υπό μελέτη δείγμα.
Η υψηλή εξειδίκευση σάς επιτρέπει να προσδιορίσετε ένα μοναδικό κομμάτι DNA ή RNA, χαρακτηριστικό ενός συγκεκριμένου παθογόνου, το οποίο αποκλείει την πιθανότητα ψευδών αντιδράσεων.
Η υψηλή ευαισθησία της μεθόδου PCR σάς επιτρέπει να εντοπίζετε ακόμη και μεμονωμένα κύτταρα παθογόνων (ιοί, βακτήρια). Η ευαισθησία του προσδιορισμού PCR είναι 10-1000 κύτταρα στο δείγμα δοκιμής (για παράδειγμα, η ευαισθησία ανοσολογικών και μικροσκοπικών δοκιμών είναι μόνο 103-105 κύτταρα).
Ανάπτυξη μιας καθολικής τεχνικής PCR για την ανίχνευση διαφόρων παθογόνων. Το αντικείμενο της έρευνας με τη μέθοδο PCR είναι το γενετικό υλικό (DNA, RNA) του παθογόνου. Η τεχνική σάς επιτρέπει να αναγνωρίζετε πολλά παθογόνα από ένα βιολογικό δείγμα.
Αρκετά γρήγορη λήψη του αποτελέσματος της ανάλυσης. Πραγματοποιείται πλήρης μελέτη σε 4-4,5 ώρες, λιγότερο συχνά λίγο περισσότερο.
Δυνατότητα ανίχνευσης παθογόνων πριν από την έναρξη των συμπτωμάτων της νόσου (προκλινική διάγνωση) και μετά την προηγούμενη ασθένεια (αναδρομική διάγνωση). Ένα παράδειγμα προκλινικών διαγνωστικών θα είναι η εξέταση κατά τη διάρκεια της περιόδου επώασης (από τη στιγμή της μόλυνσης έως την έναρξη των καταγγελιών των ασθενών), καθώς και λανθάνουσα λοίμωξη (όταν δεν υπάρχουν καθόλου συμπτώματα, αλλά μόνο εργαστηριακά δεδομένα - PCR, για παράδειγμα). Ένα από τα σημαντικά σημεία της διάγνωσης PCR είναι η εκτέλεση PCR σε αρχειακό υλικό ή βιολογικά υπολείμματα, το οποίο είναι σημαντικό για την αναγνώριση ενός ατόμου ή πατρότητας.
Επί του παρόντος, η διάγνωση PCR βρίσκεται σε σημαντική ανάπτυξη. Η ίδια η μέθοδος βελτιώνεται, νέες ποικιλίες PCR εμφανίζονται ξανά και ξανά, νέα συστήματα δοκιμών για αυτήν την αντίδραση εισέρχονται στην ιατρική αγορά. Χάρη σε αυτό, το κόστος των μελετών PCR γίνεται πιο προσιτό για ένα ευρύ φάσμα ασθενών κάθε χρόνο.
Σε τι βασίζεται η μέθοδος PCR;
Η βάση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης είναι ο πολλαπλός διπλασιασμός (ενίσχυση) μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA ή RNA χρησιμοποιώντας ένζυμα στο εργαστήριο. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται η ποσότητα DNA ή RNA, επαρκής για οπτική ανάλυση. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, αντιγράφεται μόνο το τμήμα που ταιριάζει στις καθορισμένες συνθήκες και μόνο στην περίπτωση της παρουσίας του στο δείγμα δοκιμής.
Για παράδειγμα, υλικό για έρευνα, στο οποίο θεωρείται η παρουσία θραυσμάτων DNA ή RNA του παθογόνου (σάλιο, αίμα, ούρα, εκκρίσεις από τα γεννητικά όργανα), τοποθετείται σε ειδικό αντιδραστήρα (ενισχυτής). Περαιτέρω, προστίθενται ειδικά ένζυμα σε αυτό, τα οποία συνδέονται με το DNA ή το RNA του παθογόνου, και συντίθεται ένα αντίγραφο αυτού. Αυτή η αντιγραφή πραγματοποιείται σε διάφορα στάδια ανάλογα με τον τύπο της «αλυσιδωτής αντίδρασης», και τελικά εκατοντάδες και χιλιάδες αντίγραφα μπορούν να σχηματιστούν από ένα αντίγραφο γενετικού υλικού. Έπειτα έρχεται η ανάλυση και η σύγκριση του αποτελέσματος με τη διαθέσιμη βάση δεδομένων για τη δομή των διαφόρων παθογόνων. Μέσω PCR, μπορείτε όχι μόνο να προσδιορίσετε τον τύπο του παθογόνου, αλλά και να δώσετε ένα ποσοτικό αποτέλεσμα της ανάλυσης, δηλαδή πόσα παθογόνα είναι στο ανθρώπινο σώμα.
Η μέθοδος PCR επεκτείνει επί του παρόντος το φάσμα των ερευνητικών ευκαιριών: την εισαγωγή μεταλλάξεων, το μάτισμα των θραυσμάτων DNA και έχει γίνει ευρέως διαδεδομένη στην ιατρική, για παράδειγμα, για τη δημιουργία πατρότητας, την εμφάνιση νέων γονιδίων κ.λπ.
Ποιες λοιμώξεις μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας διαγνωστικά PCR
1) Μόλυνση από τον ιό HIV (μπορεί να ανιχνευτεί ο ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας HIV-1)
2) Ιική ηπατίτιδα A, B, C, G (RNA-HAV, DNA-HBV, RNA-HCV, RNA-HGV)
3) Λοιμώδης μονοπυρήνωση (DNA του ιού Epstein-Barr-EBV)
4) Μόλυνση από κυτταρομεγαλοϊό (DNA-CMV)
5) Μόλυνση από έρπητα (DNA - ιός απλού έρπητα HSV τύπου 1 και 2)
6) ΣΜΝ (σεξουαλικά μεταδιδόμενες λοιμώξεις) - ουρεαπλάσμωση, γκαρντερίλλωση, χλαμύδια, μυκοπλάσμωση, τριχομονάση,
7) Φυματίωση (Mycobacterium tuberculosis)
8) Ογκογόνοι ιοί - λοίμωξη από ιού θηλώματος (ιός ανθρώπινου θηλώματος (συμπεριλαμβανομένων των ογκογονικών τύπων 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 και 59))
9) Μπορελίωση, εγκεφαλίτιδα που προκαλείται από κρότωνες
10) Λιστερίωση
11) Candidiasis (μύκητες του γένους Candida)
12) Μόλυνση από Helicobacter pylori
άλλα
Δεδομένου του εύρους των παθογόνων, η διάγνωση PCR χρησιμοποιείται ενεργά σε γυναικολογικές, ουρολογικές πρακτικές, πρακτικές μολυσματικών ασθενειών, στην πνευμονολογία, στη φυσιολογία, στη γαστρεντερολογία, στην αιματολογία, στην ογκολογία και σε άλλα.
Υλικό έρευνας και κανόνες για τη συλλογή του
Το υλικό για έρευνα PCR, στο οποίο μπορεί να ανιχνευθεί ξένο DNA βακτηρίων ή DNA ή RNA ενός ιού, μπορεί να είναι διάφορα βιολογικά μέσα και ανθρώπινα υγρά: βλέννα, ούρα, αίμα, πτύελα, απόξεση επιθηλιακών κυττάρων, ιστών πλακούντα, αίμα, χυμός προστάτη, αμνιακό υγρό υπεζωκοτικό υγρό.
Όταν εξετάζεται για σεξουαλικά μεταδιδόμενες λοιμώξεις (ΣΜΝ), απόρριψη από τα γεννητικά όργανα, επίχρισμα ή απόξεση από τον τράχηλο, επίχρισμα ή απόξεση από την ουρήθρα (ουρήθρα), τα ούρα λαμβάνονται από άνδρες και γυναίκες.
Όταν δοκιμάζεται για λοιμώξεις (λοιμώξεις από έρπητα, CMVI, μονοπυρήνωση, τοξοπλάσμωση, ηπατίτιδα B, C, HIV λοίμωξη), λαμβάνεται αίμα για PCR.
Για τη διάγνωση μολυσματικής μονοπυρήνωσης, CMVI, λοίμωξης από έρπητα, λαμβάνεται ένα στυλεό από το λαιμό, για εξέταση για CMVI - ούρα. Συχνά, για εξέταση βλάβης στο νευρικό σύστημα, σε αρκετές μελέτες, λαμβάνεται εγκεφαλονωτιαίο υγρό.
Στην πνευμονολογία, το υλικό είναι πτύελα, υπεζωκοτικό υγρό.
Κατά την εξέταση για ενδομήτριες λοιμώξεις - αμνιακό υγρό, πλακούντας ιστός.
Προετοιμασία για την παράδοση διαγνωστικού υλικού και PCR
Σχεδόν όλοι οι ασθενείς που υποβάλλονται σε διαγνωστικά PCR έχουν το δικαίωμα να βασίζονται σε ένα αξιόπιστο, ακριβές και γρήγορο αποτέλεσμα, ανάλογα σε μεγάλο βαθμό με τις δυνατότητες του εργαστηρίου και τον επαγγελματισμό του εργαστηρίου βοηθού. Ταυτόχρονα, πολλοί δεν πιστεύουν ότι αυτή η αξιοπιστία εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον εαυτό μας, δηλαδή από τις συστάσεις του θεράποντος ιατρού, τον τρόπο ζωής και την ορθότητα της δειγματοληψίας υλικού. Κατά τη δειγματοληψία υλικού, απαιτούνται συνθήκες που αποκλείουν τη μόλυνση (μόλυνση) του υλικού και, κατά συνέπεια, θέτουν υπό αμφισβήτηση την αντικειμενικότητα της ανάλυσης.
Η σωστή προετοιμασία για την παράδοση του υλικού δεν είναι ιδιαίτερα δύσκολη. Υπάρχουν οι ακόλουθες συστάσεις γιατρών για ασθενείς:
1) να μην ζείτε σεξουαλικά την ημέρα πριν από την παράδοση του υλικού.
2) αίμα για έρευνα χορηγείται το πρωί με άδειο στομάχι (μην τρώτε, μην πίνετε).
3) όταν χορηγείτε ούρα, το πρώτο πρωί μέρος συλλέγεται σε καθαρό αποστειρωμένο δοχείο.
Όροι ετοιμότητας ανάλυσης PCR
Το τελικό αποτέλεσμα είναι έτοιμο σε 1,5-2 ημέρες μετά την παράδοση του υλικού. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το αποτέλεσμα είναι έτοιμο την πρώτη ημέρα.
Αποκωδικοποίηση αποτελεσμάτων PCR
Αρνητικός Το αποτέλεσμα PCR δείχνει ότι δεν βρέθηκαν ίχνη μολυσματικών παραγόντων στο υπό δοκιμή υλικό κατά τη στιγμή της παράδοσης. Οι περισσότερες περιπτώσεις δείχνουν την απουσία της λοίμωξης που δοκιμάστηκε να βρεθεί στο δείγμα δοκιμής.
Θετικός Το αποτέλεσμα PCR δείχνει την ανίχνευση ιχνών μόλυνσης στο βιολογικό δείγμα που μελετάται. Με μεγάλη ακρίβεια, ένα θετικό αποτέλεσμα δείχνει την παρουσία λοίμωξης σε μια δεδομένη στιγμή.
Υπάρχουν καταστάσεις όπου η PCR είναι θετική, αλλά είναι αδύνατο να μιλήσουμε για μια ενεργή λοίμωξη - αυτός είναι ο λεγόμενος «υγιής φορέας» χωρίς κλινικά συμπτώματα της νόσου, η οποία δεν απαιτεί θεραπεία, αλλά απαιτεί δυναμική παρακολούθηση από γιατρό. Παρατηρείται συχνότερα σε έναν αριθμό ιογενών λοιμώξεων (HPV, CMVI, EBV, λοίμωξη από έρπητα και άλλα) σε υλικά όπως το σάλιο, το ξύσιμο του τραχήλου της μήτρας, η ουρήθρα, δηλαδή, από τοπική εστίαση. Ωστόσο, δεν πρέπει να ξεχνάμε ότι είναι δυνατή η μετάδοση λοίμωξης από φορείς σε υγιείς ανθρώπους, καθώς και η μετάβαση σε μια χρόνια μορφή της νόσου με ενεργοποίηση της διαδικασίας. Εάν η PCR είναι θετική στο αίμα, τότε αυτό δεν είναι πλέον φορέας και απαιτεί ειδική θεραπεία.
Το ποσοτικό αποτέλεσμα της PCR αξιολογείται μόνο από τον γιατρό ξεχωριστά για μια συγκεκριμένη μόλυνση ξεχωριστά και δεν έχει γενικές διαβαθμίσεις. Με βάση το ποσοτικό αποτέλεσμα της PCR, ο γιατρός μπορεί να καθορίσει τον βαθμό της δραστηριότητας της λοίμωξης και να καθορίσει το στάδιο της νόσου, το οποίο σίγουρα θα επηρεάσει την πορεία και τις δόσεις των συνταγογραφούμενων φαρμάκων.
Μία από τις τελευταίες ανησυχητικές ερωτήσεις: πόσο ακριβής είναι η διάγνωση PCR;
Υπάρχουν 3 ορισμοί για ανάλυση PCR:
1. Ακρίβεια (με υψηλό βαθμό πιθανότητας, ανίχνευση ή απουσία λοίμωξης είναι δυνατή).
2. Ειδικότητα (ακρίβεια ανίχνευσης συγκεκριμένης μόλυνσης).
3. Ευαισθησία (ακόμη και με χαμηλή περιεκτικότητα του γενετικού υλικού των παθογόνων στο δείγμα δοκιμής, η μόλυνση θα ανιχνευθεί).
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πρακτικά δεν δίνει ψευδή θετικά αποτελέσματα (δηλαδή, δεν υπάρχουν θετικά δείγματα όπου δεν υπάρχει λοίμωξη). Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα είναι σπάνια (συχνότερα αυτό οφείλεται στην απουσία ενεργού λοίμωξης σε ένα άτομο αυτή τη στιγμή). Για παράδειγμα, λανθάνουσα λοίμωξη, χρόνια λοίμωξη χωρίς δραστηριότητα.
Γιατρός μολυσματικών ασθενειών N.I. Bykova
Βίντεο σχετικά με το γιατί και πώς να κάνετε μια δοκιμή PCR για λοιμώξεις
Ανάλυση PCR, κάτι που δεν είναι γνωστό σε πολλούς, αν και σήμερα είναι μια από τις καινοτόμες μεθόδους διάγνωσης μολυσματικών ασθενειών, για τις οποίες ο προγραμματιστής της έλαβε το βραβείο Νόμπελ το 1993. Αυτή η μέθοδος υψηλής τεχνολογίας επιτρέπει την ανίχνευση σοβαρών ασθενειών σε πρώιμο στάδιο και την άμεση έναρξη της θεραπείας τους.
Η ανάλυση βασίζεται στις αρχές της μοριακής βιολογίας. Η έρευνα με τη μέθοδο PCR συνίσταται στη χρήση ενός ειδικού ενζύμου το οποίο, υπό την επίδραση των συνθηκών θερμοκρασίας, αντιγράφει το RNA και το DNA των βακτηρίων και των ιών που υπάρχουν στο συλλεχθέν βιοϋλικό. Αυτή η μαζική αναπαραγωγή επιτρέπει στον γιατρό να προσδιορίσει με ακρίβεια σε ποιο είδος ανήκει το βακτήριο που προκάλεσε την ασθένεια και επίσης να μετρήσει το επίπεδο της συγκέντρωσής του στο βιοϋλικό. Η διαδικασία αντιγραφής πραγματοποιείται σε μια ειδική συσκευή - έναν ενισχυτή, ο οποίος θερμαίνει και ψύχει τους σωλήνες με το συλλεγόμενο υλικό, δημιουργώντας βολικές συνθήκες για αναπαραγωγή.
Η έρευνα PCR πραγματοποιείται για πολλούς λόγους, αλλά τις περισσότερες φορές χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της παρουσίας μολυσματικών ασθενειών όπως:
- έρπης;
- γεννητικές λοιμώξεις - χλαμύδια, ουρεαπλάσμωση, γκαρντερίλλωση, τριχομονία.
- καντιντίαση;
- ηπατίτιδα;
- μονοπυρήνωση;
- λιστερίωση;
- κυτταρομεγαλοϊός;
- φυματίωση;
- ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων;
- εγκεφαλίτιδα που προκαλείται από κρότωνες.
Η ανάλυση PCR δεν περιορίζεται στο πεδίο εφαρμογής στην ιατρική, ο έλεγχος γίνεται συχνά εάν είναι απαραίτητο να κατανοηθεί ποιος κατέχει το βιολογικό υλικό που βρέθηκε στη σκηνή του εγκλήματος, δηλαδή, η ανάλυση PCR χρησιμοποιείται μαζικά στην εγκληματολογική επιστήμη. Πρέπει να σημειωθεί ότι ένα επίχρισμα ή αίμα για PCR λαμβάνεται εάν απαιτείται πατρότητα. Τα αποτελέσματα των διαγνωστικών PCR δεν είναι καθόλου κατώτερα από τη συνηθισμένη ανάλυση συγγένειας DNA και είναι πολύ φθηνότερα.
Διαγνωστικά χαρακτηριστικά
Η ανάλυση PCR έχει τεράστιο αριθμό πλεονεκτημάτων. Πρώτα απ 'όλα, είναι σημαντικό να σημειωθεί η ευαισθησία του τεστ. Ο αναλυτής PCR είναι σε θέση να προσδιορίσει τα μόρια DNA των βακτηρίων ακόμη και με τον μικρό αριθμό τους, δηλαδή, ο γιατρός λαμβάνει πληροφορίες σχετικά με το αρχικό στάδιο της νόσου ή την αρχή της χρόνιας μορφής της νόσου. Μια εξέταση αίματος PCR μπορεί ακόμη και να προσδιορίσει την παρουσία μιας μολυσματικής ασθένειας, η οποία είναι σε λανθάνουσα μορφή και δεν εκδηλώνεται.
Πρέπει να σημειωθεί ότι η ανάλυση PCR σε άνδρες και γυναίκες μπορεί να πραγματοποιηθεί παρουσία οποιουδήποτε τύπου υλικού, δεν χρειάζεται να είναι αίμα ή επίχρισμα, σάλιο, κύτταρα του δέρματος και ακόμη και ούρα είναι κατάλληλα.
Τα αποτελέσματα των αναλύσεων PCR μπορεί να είναι εκτεταμένα, καθώς η διάγνωση PCR των λοιμώξεων μπορεί να αποσπάσει ταυτόχρονα πολλά παθογόνα που βρίσκονται σε ένα δείγμα βιοϋλικών. Η εξέταση μπορεί να γίνει ανά πάσα στιγμή, πράγμα που δείχνει ότι η ανάλυση μπορεί να αναγνωριστεί από ένα άτομο σε σύντομο χρονικό διάστημα, καθώς τα αποτελέσματα των διαγνωστικών βιοϋλικών είναι έτοιμα σε 5 ώρες.
Όλοι οι γιατροί συμφωνούν ότι μια εξέταση αίματος για PCR ή άλλο υλικό δεν δίνει ποτέ λανθασμένα αποτελέσματα εάν η διαγνωστική τεχνική ακολουθείται σωστά. Το PCR θετικό ή το PCR αρνητικό μπορεί να είναι ψευδές μόνο υπό συνθήκες που το προσωπικό του εργαστηρίου δεν έχει υψηλό επίπεδο επαγγελματισμού. Εάν το κατασχεθέν βιοϋλικό μολύνθηκε ή αποθηκεύτηκε ακατάλληλα, τότε η αποκωδικοποίηση της ανάλυσης PCR μπορεί να έχει παραμορφωμένα αποτελέσματα.
Προετοιμασία για διαγνωστικά
Ένα επίχρισμα για PCR σε γυναίκες από τον τράχηλο λαμβάνεται εάν απαιτείται για τον προσδιορισμό των σεξουαλικά μεταδιδόμενων ασθενειών, για παράδειγμα, χλαμύδια, ουρεάπλασμα ή έρπητα. Εάν απαιτείται ένας PCR για αυτά τα βακτήρια σε έναν άνθρωπο, τότε η απόρριψη από την ουρήθρα λαμβάνεται από αυτόν - ο χυμός του προστάτη, με άλλα λόγια. Το αίμα εξετάζεται με PCR εάν θέλει να προσδιορίσει την ηπατίτιδα, την τοξοπλάσμωση και τον HIV. Πραγματοποιείται ανάλυση PCR για μονοπυρήνωση και κυτταρομεγαλοϊό αφαιρώντας ένα επίχρισμα από το λαιμό. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για την παρουσία πνευμονικών λοιμώξεων πραγματοποιείται με την παρουσία ενός βιοϋλικού όπως πτύελα ή υπεζωκοτικό υγρό.
Η PCR κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης γίνεται εάν υπάρχει υποψία ενδομήτριων λοιμώξεων, καθώς και ασθενειών και παθολογιών του νευρικού συστήματος του εμβρύου. Ως βιοϋλικό για έρευνα, ο ιστός του πλακούντα λαμβάνεται από έναν εγκυμοσύνη. Εάν ένα άτομο έχει βλάβη του νευρικού συστήματος, εξετάστε το εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Για τον προσδιορισμό ενός βακτηρίου όπως το Helicobacter pylori, χρησιμοποιούνται βιοψίες του στομάχου και του δωδεκαδακτύλου.
Η PCR ούρησης επίσης χρησιμοποιείται συχνά, αλλά είναι λιγότερο προτιμότερη από μια εξέταση αίματος. Σας επιτρέπει να δείτε την παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών που προκαλούν μολυσματικές ασθένειες, αλλά δεν μπορούν να δείξουν τον ακριβή αριθμό τους και τον βαθμό ανάπτυξης της νόσου. Η PCR των ούρων χρησιμοποιείται εάν δεν είναι δυνατόν για κάποιο λόγο να αφαιρεθεί το αίμα ή να γίνει επίχρισμα. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι μπορεί να πραγματοποιηθεί PCR ούρων για τη διερεύνηση λοιμώξεων σε μικρά παιδιά. Η ούρηση μπορεί επίσης να προσδιορίσει την παρουσία λοίμωξης και φλεγμονής στην ουροδόχο κύστη, να προσδιορίσει πέτρες, άμμο, καθώς και κυστίτιδα και ουρηθρίτιδα.
Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, μπορείτε να κάνετε μια δοκιμή PCR εάν έχετε οποιοδήποτε βιοϋλικό. Ανάλυση PCR, τι είναι, ξέρετε, πρέπει επίσης να γνωρίζετε την προετοιμασία για τη διάγνωση. Η προετοιμασία εξαρτάται άμεσα από το τι πρέπει να αφαιρεθεί, για παράδειγμα, πρέπει να δώσετε ούρα μετά από ενδελεχή υγιεινή των γεννητικών οργάνων το πρωί. Το αίμα χορηγείται με άδειο στομάχι, κατά τη διάρκεια του τοκετού, ή μάλλον, την προηγούμενη ημέρα, είναι απαραίτητο να σταματήσετε να χρησιμοποιείτε φάρμακα. Εάν υπάρχουν χρόνιες παθήσεις, τότε ο κατάλογος των εγκεκριμένων φαρμάκων για χρήση αποφασίζεται ξεχωριστά από τον θεράποντα ιατρό.
Η ανάλυση κοπράνων λαμβάνεται το πρωί μετά από προσεκτική προετοιμασία. Την παραμονή της παράδοσης, είναι απαραίτητο να εγκαταλείψετε τα βαριά τρόφιμα και να εκτελέσετε πλήρη υγιεινή των γεννητικών οργάνων. Η ανάλυση των περιττωμάτων θα είναι αναξιόπιστη εάν το βιοϋλικό αφαιρεθεί χρησιμοποιώντας ένα κλύσμα, είναι απαραίτητη η φυσική κάθοδος του υλικού. Δεν απαιτείται προετοιμασία για την παράδοση σάλιο, αρκεί να καπνίζετε, πίνοντας χυμό εσπεριδοειδών.
Πριν από την υποβολή βιοϋλικού για τον προσδιορισμό ασθενειών που μεταδίδονται κατά τη διάρκεια του σεξ, οι ασθενείς πρέπει να αποκλείσουν τη σεξουαλική επαφή δύο ημέρες πριν από τη διάγνωση PCR. Απαγορεύεται στις γυναίκες να πάρουν ένα επίχρισμα από τον τράχηλο κατά τη διάρκεια κρίσιμων ημερών, δύο ημέρες μετά την εμμηνόρροια, διαφορετικά η αποκρυπτογράφηση PCR θα έχει παραμορφωμένες πληροφορίες.
Αποτελέσματα διαλογής
Ένας αποκλειστικά καταρτισμένος γιατρός μπορεί να εξηγήσει λεπτομερώς τι λέει μια τέτοια ανάλυση PCR για την κατάσταση ενός συγκεκριμένου ασθενούς, δεν θα είναι εύκολο να κατανοήσουμε ανεξάρτητα τα δεδομένα που αναφέρονται στη φόρμα. Εάν ζητήσετε από τον γιατρό να αποκρυπτογραφήσει τα δεδομένα, πρώτα απ 'όλα θα πει εάν το αποτέλεσμα είναι θετικό ή αρνητικό. Εάν η ανάλυση είναι αρνητική, τότε το άτομο είναι υγιές και δεν βρέθηκαν βακτήρια στο δοκιμαστικό υλικό. Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος, αναφέρεται ο ακριβής τύπος παθογόνου και η ποσότητα του, μπορείτε επίσης να μάθετε την ακριβή περίοδο κατά την οποία υπήρχε μόλυνση από την παρουσία ορισμένων ανοσοσφαιρινών.
Υπάρχουν αρκετές κατηγορίες ανοσοσφαιρινών που μπορούν να αντανακλούν σαφώς την κατάσταση του ασθενούς:
- Τα IgG αναπτύσσονται στο αίμα μετά από 4 εβδομάδες μόλυνσης και μπορούν να παραμείνουν στο αίμα για αρκετά χρόνια. Δεν είναι πάντα δείκτες βακτηρίων, μερικές φορές βγαίνουν ως μνήμη του σώματος που κάποτε αντιμετώπιζε έναν παρόμοιο τύπο παθογόνου.
- IgM - εμφανίζονται στην αρχή μετά τη μόλυνση. Κατά κανόνα, είναι ορατά ήδη την 5η ημέρα, αυτοί είναι οι πρώτοι υπερασπιστές του σώματος που επιτίθενται στο βακτήριο. Εξαφανίζονται από το αποτέλεσμα του αίματος μετά από δύο εβδομάδες. Εάν υπάρχουν στην εξέταση αίματος, τότε μπορεί να υποτεθεί ότι η λοίμωξη εμφανίστηκε πολύ πρόσφατα, περίπου πριν από μια εβδομάδα.
- Η IgA σηματοδοτεί μια οξεία ανάπτυξη βακτηριακής λοίμωξης στο σώμα ή ένα επαναλαμβανόμενο στάδιο μιας χρόνιας ασθένειας.
Υπάρχουν ορισμένες περιπτώσεις όπου η ανάλυση δείχνει θετικό αποτέλεσμα, αλλά το άτομο δεν αισθάνεται καθόλου άσχημα. Αυτό δεν σημαίνει καθόλου σφάλμα στη διάγνωση · μάλλον, υπάρχει μια χρόνια μορφή της νόσου, η οποία βρίσκεται σε αδρανή κατάσταση ή η ανάπτυξη της νόσου μόλις ξεκινά. Προς το παρόν, δεν υπάρχουν αρκετά βακτήρια που να προκαλούν συμπτώματα.
Τώρα γνωρίζετε την αρχή της ανάλυσης και μπορείτε να υποβάλετε αίτηση για αυτήν τη διάγνωση εάν εμφανιστεί η ελάχιστη υποψία μολυσματικής ασθένειας. Η διάρκεια της περαιτέρω θεραπείας και η αποτελεσματικότητά της εξαρτώνται άμεσα από το πόσο γρήγορα περνάτε τη διάγνωση, η οποία είναι πρακτικά ανώδυνη. Για να διατηρείτε συνεχώς την υγεία σας σε καλό επίπεδο, συνιστάται να υποβάλλονται σε προληπτικά διαγνωστικά PCR για ΣΜΝ, καθώς και λοιμώξεις άλλων οργάνων, μία φορά το χρόνο. Είναι καλύτερο να αποτρέψετε την ασθένεια παρά να αντιμετωπίσετε τις συνέπειές της αργότερα.